Ribosa - atp 32

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Un ensayo rápido para la bioquímica ribokinase ANALÍTICA 75, 660-663 (1976) un ensayo rápido para Ribokinase Un método rápido es capaz de ribosa lineal detectar niveles bajos de ribokinase se se da. PATP a de al menos convertidos El IOF para 5-32Pphosphate de enzima que no absorbible un carbón de leña inferior. mg ensayo de enzima / ml. es la concentración de limitar 4 X La primera enzima en la biosíntesis de (CE 2.7.1.15), cataliza la conversión por la ecuación. ll. la utilización de ribosa ATP de ribosa a ribosa 5phosphate de la ribosa, ribokinase Mg2 ribosa 5phosphate ADP. Esta enzima enfermos era de interés para nosotros como un medio de obtener la ribosa 5-fosfato de ribosa de alta actividad específica. ensayo para ribokinase (1) se basó en la precipitación con Ba y solución de determinación por el ensayo de orcinol. Hemos encontrado en este método y por lo tanto hemos ensayo que utiliza la transferencia de 32P de Y - PATP a ribosa. El radiomarcado anterior de la ribosa 5-fosfato en el sobrenadante varias deficiencias una rápida y sensible de la ribosa restante MÉTODOS Y MATERIALES desarrollados Y - PATP (2). Otros productos químicos se preparó la albúmina determinada como un estándar. El ribokinase para 5phosphoribosylpyrophosphate por adición de una pequeña alícuota ribosa fosfato de potasio, MgCl 2 mM. La reacción se detuvo por adición de ácido, y la solución Norit carbón activado Zimmerman, Ref. (5) se añadió, y la mezcla de 15 min a 0ºC. De sodio que contiene 5 mg / ml de bovino se mezcló vigorosamente y se centrifuga, la solución se colocó en 10 ml de Aquasol que se contó en un líquido se preparó por el método de Glynn y Chappell eran de costumbre comercial como se describe anteriormente por el método de las fuentes de Lowry . concentraciones Ribokinase (1). Protein et al. (3) el uso de bovino fue ensayo de suero es similar al procedimiento descrito por Switzer sintetasa de enzima (2-20 pg) a 0,5 ml de tampón 0,1 M, pH 7,5, a 37ºC y que contenía 3 mM y-32PATP de 0,5 ml de frío 5 perclórico se incubó a 0ºC durante 15 min. Lavado con ácido (0,3 ml de 20, v / v, preparado (4). El ensayo se inició cpm 5 mM). (60.000-100.000 según para se incubó albúmina de suero de pirofosfato (0,2 ml de 50 mM), se añadió, el material y 0,5 ml del sobrenadante (New England centelleo espectrómetro. PH 7,0, Nuclear) Recuperación de 660 Copyright Todos 0 1976 por . Academic Press Inc. Todos los derechos de reproducción en cualquier forma reservada COMUNICACIONES BREVES 91 IIIII 6- 7-:. 6- T zJ 5- B s .- E g ae 6 4- 3- 2- 0.40mg / ml 661 TIEMPO (min .), Fig. 1. Porcentaje de conversión cincuenta microlitros de ribokinase resultó en un aumento lineal de nonadsorbable de ATP a ribosa 5-fosfato representa aproximadamente contenía o bien no ribosa, quinasa, o ribokinase inactivado por calor (0,4 mg / ml, 100C para I5 min). Todos los controles mostró un aumento insignificante en el recuento. de y-3ZPATP a nonadsorbable que contiene las concentraciones de proteínas totales indicados 3zP con el tiempo. el diez por ciento de conversión 6000 cpm medidas. Controls 5 mM ribosa 5-fosfato en lugar de ribosa, o ribo - 32P en función del tiempo. ribosa re Sphosphate tratada solución de ensayo se probó por resubjecting a la adsorción de carbón un procedimiento alícuota. RESULTADOS de carboneros Figura 1 muestra el curso temporal para la transferencia de 32P a la ribosa por diferentes concentraciones de ribokinase. Una relación de 5: 3: 1 para la ribosa: ATP: Mg2 presente. Todas las reacciones fueron esencialmente transfieren reacción era directamente proporcional En ausencia de cualquiera de los recuentos de ribokinase activos por minuto por encima del fondo ribosa Sphosphate también dio ningún aumento en el recuento, lo que indica la preparación ribokinase no estaba contaminado sintetasa pirofosfato, phosphoribokinase, Esencialmente 100 de recuperación de sintetizado obtenido. Una alícuota del sobrenadante fue lineal. La figura 2 muestra que la concentración de ribosa o no a aumentar los niveles se encontró durante un máximo de 20 minutos. de enzima. en que el por Sphosphoribosyl - o una ATPasa. ribosa 5-r2Pphosphate que contienen 4277 cpnxJO.5 ml después de 662 COMMUNICATIONS, la concentración de proteína. n-q / ml FIG. 2. Tasa de incremento de pistas nonadsorbable de la Fig. 1 se representan como una función de la concentración de proteína. 32P frente a la concentración de proteínas. La primera de adsorción de carbón de adsorción de carbón, la adsorción y la ribosa 5-32Pphosphate contenida en la dilución triple. 1429 cpm / ml después de utilizar un segundo modo, tanto la recuperación PATP Y - son cuantitativos. resultante Discusión Hemos encontrado actividad de la quinasa de coprecipitación incompleto para la ribosa debido a la presencia de etanol. rápida y, ya que no requiere la capacidad controlado con precisión de comercial Sin embargo, este ensayo sería de restringido fosforribosilpirofosfato Taining una ATPasa. La presencia en demasiado grande un aumento en consecuencia nonadsorbable en un aumento espuria. El mejor control para el fondo no se debe a ribokinase es llevar a cabo añadido ribosa Sphosphate lugar de ribosa. la ya difícil precipitación de ribosa, informó procedimiento de ensayo El método por el etanólico de ribosoma es Ba2 tema, utilizar cuantitativamente. de ribosa Sphosphate y rendimiento de color rebajado en el orcinol No se requiere el procedimiento analítico extensa método. Y - ATP hace que el ensayo en especial la prueba informó aquí es la manipulación de la muestra, es un cómodo La disponibilidad. utilizan en preparaciones sintetasa, phosphoribokinase, de los dos ex-32P, mientras que un con - ATPasa o enzimas ocasionaría haría el ensayo de la actividad en presencia de acuses de recibo pre Este trabajo fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de Estados Unidos (NIH-l-rol-GM20835 ). Agradecemos al Dr. Daniel Purich para un regalo de yzPATP. Referencias 1. Horecker, Chem. B. L. Gibbs, M. Klenow, 207, 393-403. H. y Smyrniotis, P. Z. (1954) J. Biol. SHORTCOMMUNICATIONS 663 2. Glynn, I. M. y Chappell, J. B. (14) Biochem. 3. Lowry, 0. H. Rosebrough, Chem. 193,265-275. 4. Switzer, R. L. (19) J. 5. Zimmerman, S. B. (1963) en Methods in Enzymology, (Colowick, eds N. O..), Pp. 258-262, Academic Press, New York. J. 90, 147-149. N. J. Farr, A. L. y Randall, R. J. (1951) J. Biol. Biol. Chem. 244, 2854-2863. S. P. y Kaplan, Robert K. Goitein Stanley M. Departamento de la Universidad de Santa PARSONS recibidos de Química de California Barbara, California 93106 Febrero 9, 1976 aceptado el 20 de mayo de 1976 Texto completo