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Hacia un nuevo medicamento para la tuberculosis: pyridomycin naturalezas isoniazida Resumen La tuberculosis, una amenaza global para la salud pública, se está convirtiendo intratable debido a la generalizada resistencia a los medicamentos de primera línea a las drogas como la isoniazida InhA-inhibidor. Históricamente, mediante la inhibición de objetivos altamente vulnerables, productos naturales han sido una fuente importante de antibióticos, incluyendo agentes antituberculosos potentes. A continuación, describimos pyridomycin, un compuesto producido por fulvum Dactylosporangium con la actividad bactericida específica contra las micobacterias. Mediante la selección de mutantes resistentes a pyridomycin de Mycobacterium tuberculosis. secuenciación de todo el genoma y la validación genética, hemos identificado el enoyl - dependiente de NADH (Acil-Carrier-proteína) reductasa InhA como el principal objetivo y demostrar que pyridomycin inhibe la síntesis de ácidos micólicos de M. tuberculosis. Además, los estudios bioquímicos y estructurales muestran que pyridomycin inhibe InhA directamente como un inhibidor competitivo del sitio de unión de NADH, identificando de este modo un nuevo bolsillo, druggable en InhA. Es importante destacar que los aislados clínicos resistentes a la isoniazida más frecuentemente encontradas permanecen totalmente susceptibles a pyridomycin, abriendo así nuevas vías para el desarrollo de fármacos. En el documento se explica Incluso hoy en día, la infección por Mycobacterium tuberculosis cuentas de hasta dos millones de muertes al año. La efectividad de los fármacos antituberculosos actuales para combatir estas infecciones está cada vez más comprometida por la creciente prevalencia de la tuberculosis multi y extremadamente resistente. Para estos casos, los compuestos antituberculosos más eficaces, tales como la isoniazida y la rifampicina ya no son eficaces, y esto puede resultar en tasas de mortalidad cercana al 100 para los pacientes con tuberculosis resistente a fármacos. Por estas razones, es imperativo asegurar que la tubería de candidatos a fármacos para el tratamiento de la tuberculosis está bien llenada. Mostramos aquí que la pyridomycin producto natural es un compuesto bactericida muy selectiva contra las micobacterias incluyendo Mycobacterium tuberculosis. la bacteria causante de la tuberculosis en los seres humanos. Al seleccionar y aislar M. tuberculosis mutantes resistentes a pyridomycin y secuenciación de su genoma, se encontró que una única mutación en un gen llamado inh es responsable de la resistencia. InhA ya es el objetivo de la corriente antituberculosis isoniazida agente de primera línea. Sin embargo, lo más interesante, no se observó resistencia cruzada entre pyridomycin e isoniazida, tanto en cepas de laboratorio que contienen mutaciones en InhA o en los aislados clínicos resistentes a la isoniazida más encontradas con frecuencia que contienen mutaciones en katG (un gen necesario para activar la isoniazida). A continuación, presentamos estudios genéticos y bioquímicos detallados para confirmar que pyridomycin sí mismo inhibe InhA y que en bacterias vivas, esta inhibición conduce a la disminución de los ácidos micólicos, un componente esencial de la pared celular. Por último, los estudios de la estructura cristalina de la proteína InhA y la forma pyridomycin resistente dan información valiosa sobre el bolsillo de unión de pyridomycin. La inhibición de InhA es uno de los medios más eficaces para matar Mycobacterium tuberculosis. y este es el mecanismo detrás de uno de los agentes antituberculosos más potentes utilizados actualmente: isoniazida. La creciente aparición de tuberculosis multi - y extremadamente resistente (ambos de los cuales son resistentes a la isoniazida) significa que para estos casos, este objetivo ya no puede ser inhibida eficazmente por la terapia actual. Nuestro hallazgo de que pyridomycin mata M. tuberculosis mediante la inhibición de InhA (incluso en aislados clínicos resistentes a la isoniazida) proporciona una base prometedora para el desarrollo de pyridomycin o un agente relacionado para el tratamiento de la tuberculosis resistente a la isoniazida. INTRODUCCIÓN En la actualidad, la infección por Mycobacterium tuberculosis cuentas para un máximo de dos millones de muertes al año (Glaziou et al, 2009). Los principales factores de confusión tales como la pobreza, la falta de vivienda y la prevalencia de VIH / SIDA (Harrington, 2010) significan que la tuberculosis se mantendrá indefinidamente una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Por otra parte, a pesar de la pequeña, pero creciente número de medicamentos que son eficaces para matar M. tuberculosis. el tratamiento actual todavía está lastrado por su duración (normalmente de 6 meses para las cepas sensibles al fármaco) y el número cada vez mayor de múltiples fármacos (MDR) y extensivamente resistente a los medicamentos (XDR) aislamientos clínicos de M. tuberculosis (Cegielski, 2010). En conjunto, esto subraya la necesidad de que las entidades terapéuticas alternativas que se pueden utilizar tanto para acortar la duración del tratamiento y para combatir el creciente problema de la resistencia a los medicamentos clínica. Los productos naturales han proporcionado durante mucho tiempo una fuente rica de agentes anti-eficaz de la tuberculosis. El más activo de éstos en el uso actual, las rifamicinas (rifampicina, rifabutina y rifapentina), inhiben la ARN polimerasa y son cruciales para el tratamiento de primera línea de la enfermedad. Por otra parte, varios otros productos naturales como los aminoglucósidos (estreptomicina, amikacina y kanamicina) y el antibiótico péptido (capreomicina) son parte de la cartera actual de los fármacos antituberculosos. La rica diversidad de productos naturales representa una poderosa herramienta para el descubrimiento de fármacos, en primer lugar, en forma de cables para potenciales agentes anti-microbianos y en segundo lugar, como un medio para identificar aquellos objetivos que son los más vulnerables en la bacteria. En 1953, pyridomycin fue descrita por primera vez como un antibiótico que presentaba una actividad específica contra diferentes micobacterias incluyendo M. tuberculosis y M. smegmatis (Maeda et al, 1953). Pyridomycin (Fig 1A) es producido por Streptomyces pyridomyceticus (Maeda et al, 1953 Yagishita, 1954. 1955. 1957a. B) o fulvum Dactylosporangium (Shomura et al, 1986). Su biosíntesis se estudió por primera vez en 1968 (Ogawara et al, 1968) y, más recientemente, en 2011 (Huang et al, 2011) cuando se propuso la participación de ambos sintetasas no ribosómicas de péptidos (PNR) y policétido sintasas (PKS). A pesar de este cuerpo de trabajo, el mecanismo de acción de pyridomycin contra M. tuberculosis es desconocida, y su potencial como un compuesto anti-tuberculosis no se ha evaluado. Figura 1. Estructura química y la actividad intracelular de pyridomycin. Estructura química de pyridomycin. La actividad de pyridomycin en intracelular de M. tuberculosis fue probado en los macrófagos derivados de células THP-1 activados. Las células se infectaron a una MOI de 1: 1 con M. tuberculosis Erdman y tratados con isoniazida (INH) a 1 g / ml. unidades formadoras de colonias (CFU) se determinaron después de 7 días de exposición a las drogas. NT se refiere a la muestra no tratada y NT0 a muestra no tratada en el tiempo 0. El experimento se realizó por duplicado y los resultados se muestran como valores medios y los errores estándar. El objetivo de este estudio era determinar cómo pyridomycin mata a M. tuberculosis y para identificar su objetivo. Para lograr esto, se describe una combinación de enfoques que implican la cartografía de resistencia, la validación genética, la bioquímica, la inhibición de la enzima y el análisis cristalográfico de rayos X del objetivo. Los resultados combinados de forma inequívoca indican que pyridomycin es un inhibidor competitivo del sitio NADH de unión de InhA, dependiente de NADH reductasa enoil-acil-Carrier-Protein, el objetivo de los dos etionamida anti-tuberculosis profármacos isoniazida y (Banerjee et al , 1994 Vilcheze et al, 2006). RESULTADOS Purificación de pyridomycin Varias cepas de Streptomyces pyridomyceticus (NRRL B-2517, ISP-5024 y DSM40024) se ensayaron inicialmente para pyridomycin producción con éxito limitado, probablemente debido a la presencia de productoras y no productoras de poblaciones de la misma cultura. Pyridomycin (Fig 1A) fue, sin embargo, se producen fácilmente por y purificado de Dactylosporangium fulvum (NRRL B-16292) con un rendimiento de 2099 y con un espectro de RMN como se informó anteriormente (Kinoshita et al, 1989). propiedades anti-bacterianas de pyridomycin Pyridomycin se ha descrito para actuar específicamente contra micobacterias, con poca o ninguna actividad frente a otras especies Gram-positivos y Gram-negativos (Maeda et al, 1953). Con el fin de verificar su espectro de actividad, se utilizó el ensayo de microplaca de reducción de resazurina (REMA) para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) para diversas bacterias. De la Tabla 1. Se puede ver claramente que pyridomycin es eficaz contra todos los miembros del género Mycobacterium probado incluyendo M. tuberculosis (cepa H37Rv, MIC Maeda, 1957) y sugieren que pyridomycin se dirige a un componente de micobacterias que es ya sea suficientemente divergente o ausente en otros géneros. Tabla 1. susceptibilidad bacteriana a pyridomycin medido por resazurina ensayo de microtitulación reducción Pyridomycin MIC (g / ml) Para entender mejor las propiedades de pyridomycin contra M. tuberculosis. se determinó su concentración bactericida mínima (CBM) y su actividad frente a no replicante e intracelular de M. tuberculosis mide. MBC datos demostraron que pyridomycin es bactericida contra M. tuberculosis H37Rv en concentraciones de 0.62log (Figura 1B). Pyridomycin tanto, es claramente capaz de entrar en los macrófagos y detener la replicación bacteriana. Citotoxicidad de pyridomycin en líneas celulares humanas Para determinar si pyridomycin es citotóxica para las células humanas, la citotoxicidad dependiente de la concentración del compuesto se evaluó en dos líneas celulares humanas. Los datos indicaron que la cantidad de pyridomycin necesaria para matar el 50 de las células HepG2 (línea celular hepática humana) o células A549 (línea celular de epitelio de pulmón humano) fue 100 y 50 mg / kg inyección intraperitoneal (Maeda et al, 1953). Identificación de la pyridomycin objetivo La estrategia para identificar el objetivo y mecanismo de acción de pyridomycin era elevar mutantes pyridomycin resistente y para identificar las mutaciones genéticas responsables de este fenotipo, anticipando que estas mutaciones estarían en el gen de la diana de fármaco. Se seleccionaron los mutantes resistentes de la cepa H37Rv en medio sólido que contiene pyridomycin a 106. De las 10 colonias seleccionadas para su posterior análisis (PYR1 a 10), nueve mostraron ningún cambio en el MIC para pyridomycin cuando se re-probado por REMA, mientras que el mutante retuvo una PYR7 cerca de aumento de 10 veces en su nivel de resistencia en comparación con el padre H37Rv (Fig 2). Este fenotipo se mantiene de manera estable y mutante PYR7, siguen siendo sensibles a la isoniazida, rifampicina y moxifloxacina como de tipo salvaje H37Rv (Fig 2). Figura 2. validación genética de InhA como el objetivo de pyridomycin. La susceptibilidad compuesto de tipo salvaje H37Rv transformada con los pMV261 de control de vectores (cuadrados rellenos), pMVinhA (cuadrados vacíos), pMVinhA (S94A) (triángulo abierto) o pMVinhA (D148G) (círculo abierto) a: moxifloxacino (A), ( B) isoniazida o pyridomycin (C). La susceptibilidad compuesto de mutante pyridomycin resistente PYR7 transformada con los pMV261 de control de vectores (cuadrados rellenos), pMVinhA (cuadrados), pMVinhA (S94A) (triángulo abierto) o pMVinhA (D148G) (círculo abierto) a: moxifloxacino (D), (E) isoniazida o pyridomycin (F). Para identificar los polimorfismos de nucleótido único (SNP) o de inserción / supresiones (indeles) responsable de la resistencia pyridomycin, los genomas de ambos PYR7 y la cepa parental se secuenciaron para cerca de la finalización por el protocolo Illumina. El noventa y ocho por ciento de las lecturas fueron asignadas con éxito para el genoma de referencia H37Rv (Cole et al, 1998), resultando en un promedio de cobertura 300 veces. La comparación de los conjuntos PYR7 y H37Rv reveló 63 SNPs de los cuales 53 asigna a la educación física repetitiva y PPE familias de genes y por lo tanto fueron descartados. De los 10 SNPs restantes, nueve eran sinónimos. La única mutación no sinónima encontrado fue una transición a443g en inh lo que resulta en la sustitución del ácido aspártico en la posición 148 por una glicina (D148G). Esta mutación sin sentido se confirmó posteriormente mediante secuenciación de Sanger convencional. Con referencia a las estructuras previamente publicadas de la reductasa enoil-ACP dependiente de NADH InhA, se encontró Asp148 que se encuentra cerca del bolsillo de unión NADH (Dessen et al, 1995 Dias et al, 2007 Molle et al, 2010 Oliveira et al, 2006 Rozwarski et al, 1999 Vilcheze et al, 2006). validación genética de InhA como el objetivo de pyridomycin Para validar genéticamente InhA como el objetivo de pyridomycin, evaluamos si la sobre expresión de inh provocó un aumento de la resistencia a los antibióticos de tipo salvaje de M. tuberculosis. Para este propósito, transformamos H37Rv cepa con un plásmido que lleva el gen inh bajo el control del promotor hsp60 (pMVinhA Larsen et al, 2002). En la figura 2. Puede verse que H37Rv :: pMVinhA muestra un 15 veces mayor MIC para pyridomycin en comparación con la cepa de control H37Rv :: pMV261 (0,31-5 Fig 2). En experimentos de control, la sobreexpresión de inh también condujo a un aumento de resistencia a la isoniazida en ambas cepas, mientras que no impactar la MIC de moxifloxacino (Fig 2). En conjunto, estos datos genéticos sugieren fuertemente que InhA es el objetivo de pyridomycin. Para corroborar que la mutación D148G en inh era de hecho responsable de pyridomycin resistencia, overexpressed este alelo en H37Rv y se comparó su efecto con el de una mutación bien caracterizado asociado con resistencia a la isoniazida, InhA (S94A) (Vilcheze et al, 2006) . Los resultados presentados en la figura 2 muestran claramente que, en comparación con la sobreexpresión de tipo salvaje InhA (pMVinhA), la sobreexpresión de InhA (D148G) causa cuatro veces mayor resistencia a pyridomycin mientras que la sobreexpresión de InhA (S94A) confirió única resistencia doble. Por otra parte, la sobreexpresión de InhA (D148G) no tuvo ningún impacto en el MIC para la isoniazida en comparación con la sobreexpresión de tipo salvaje InhA, mientras que, como era de esperar, la sobreexpresión de InhA (S94A) aumento de la resistencia alrededor de cuatro veces (figura 2). Ninguna de las mutaciones afectadas la MIC para moxifloxacino (Fig 2). En conjunto, los datos demuestran que la mutación D148G en InhA es responsable de la resistencia a pyridomycin, mientras que no afecta notablemente la actividad de la isoniazida. Además de la isoniazida, InhA es también el objetivo de etionamida y triclosan. Los estudios de susceptibilidad utilizando estos compuestos en H37Rv y PYR7 indican que las dos cepas son igualmente sensibles con CIM de 2,0 y 12,5 g / ml, respectivamente. Esta falta de resistencia cruzada indica que D148G en InhA es probable que tenga ningún impacto en la unión a InhA de cualquiera de triclosan o el metabolito activo de la etionamida, el aducto etionamida-NAD. La susceptibilidad de los aislados clínicos resistentes a la isoniazida a pyridomycin Desde nuestros hallazgos indican que pyridomycin tiene el mismo objetivo que la isoniazida, se investigó si los aislados clínicos resistentes a la isoniazida de M. tuberculosis retenidos susceptibilidad a pyridomycin. A medida que la isoniazida es un profármaco, las mutaciones clínicamente relevantes que confieren resistencia se encuentran con frecuencia en el gen katG que codifica la catalase15) t promotor de mutación que se muestra resistencia cruzada con pyridomycin, mientras que los katG (S315T) mutantes más comunes resistentes a la isoniazida conservan plena sensibilidad al antibiótico. Tabla 2. Actividad Pyridomycin frente a aislados clínicos resistentes a la isoniazida de M. tuberculosis La inhibición de la síntesis de ácidos micólicos de pyridomycin Se ha elegantemente demostrado que la inhibición de InhA por isoniazida en M. tuberculosis conduce a la depleción específica de ácidos micólicos de la pared celular bacteriana sin afectar a la síntesis de ácidos grasos (Vilcheze et al, 2006). Para demostrar que la inhibición de la pyridomycin InhA también resulta en la inhibición de la síntesis de ácidos micólicos, se determinó el contenido de ácidos micólicos y graso de M. tuberculosis en presencia y ausencia de pyridomycin por cromatografía en capa fina radiométrica (TLC). Se encontró que pyridomycin causó una reducción dependiente de la concentración de la síntesis de ácidos micólicos (alfa-, metoxi - y ácidos ceto-micólicos), mientras que no afecta el contenido de ácido graso (Fig 3). Además, cuando se realiza el mismo experimento en PYR7, más de cinco veces mayor pyridomycin se necesitaban concentraciones para inhibir la biosíntesis de los ácidos micólicos en consonancia con el nivel de resistencia observado. Tanto H37Rv y PYR7 comportaron de manera similar cuando el ensayo se repitió en presencia de isoniazida (Fig 3). De hecho, este último causó una disminución dependiente de la concentración en la cantidad de ácidos micólicos en H37Rv y fue igualmente eficaz en la inhibición de la síntesis de ácidos micólicos en PYR7. En conjunto, estos datos confirman que la síntesis de objetivos pyridomycin ácidos micólicos y demuestran que la enzima InhA (D148G) en PYR7 es mucho menos susceptible a la inhibición pyridomycin. Figura 3. La inhibición de la síntesis de ácidos micólicos por pyridomycin. El éster metílico de ácidos grasos (FAME) y los perfiles de éster metílico de ácidos micólicos (Mamés) de tipo salvaje y mutante H37Rv pyridomycin resistente PYR7 fueron evaluados por cromatografía en capa fina. Ambas cepas fueron tratados con diferentes concentraciones de isoniazida y pyridomycin durante 3 h y se marcaron con 1,2-14 C-acetato. 14 FAME y etiquetados Mames-C se separaron mediante cromatografía en capa fina y se detectaron por autorradiografía. La cuantificación de la intensidad de la banda MAME en relación con la densidad de la FAMEs ilustra la inhibición de la síntesis de MAME por pyridomycin (B) e isoniazida (C) en H37Rv (cuadrados negros) y PYR7 (círculos abiertos). Inhibición in vitro de InhA por pyridomycin Inhibición de InhA purificado por pyridomycin se estudió para investigar si pyridomycin solo puede inhibir la enzima o si es necesario in vivo bio-activación por un proceso intracelular. InhA, InhA (S94A) y InhA (D148G) se expresaron con éxito y purificado. Todos los tres enzimas eran catalíticamente activo y se oxida NADH en presencia del sustrato 2-trans-octenoyl-CoA (OcCoA). Los experimentos iniciales determinaron la constante (K m) y confirmó que para InhA (S94A) era alrededor de 6,5 veces superior a la de tipo salvaje InhA (Tabla 3) como se informó anteriormente unión de NADH (Quemard et al, 1995 Rawat et al, 2003 Vilcheze et al, 2006). Sorprendentemente, se encontró que la K m de InhA (D148G) para NADH era 14 veces mayor que para los de tipo salvaje InhA (Tabla 3) lo que sugiere una menor afinidad por el NADH en el mutante D148G. Todas las enzimas tenían un V similares max (alrededor 0.52Burk parcelas (Fig 4). Estos datos demuestran que pyridomycin es el farmacóforo que inhibe InhA, y esta actividad se consigue mediante la inhibición competitiva del sitio de unión a NADH. Además, estos bioquímicos y enzymological resultados confirman que InhA (D148G) es más resistente a pyridomycin mientras InhA (S94A) es tan sensible como la enzima de tipo salvaje. Tabla 3. parámetros cinéticos in vitro de M. tuberculosis InhA y su inhibición por pyridomycin estructuras cristalinas de InhA ( D148G), de tipo salvaje InhA y InhA (S94A) para investigar más a fondo el modo de unión de pyridomycin a InhA a nivel atómico, hemos cristalizado y resuelto las estructuras de tipo salvaje InhA y InhA mutante (S94A) en el complejo con NADH como previamente publicado (Dessen et al, 1995 Dias et al, 2007 Molle et al, 2010 Oliveira et al, 2006 Rozwarski et al, 1999 Vilcheze et al, 2006). en un intento de obtener estructuras cristalinas de InhA en complejo con pyridomycin, pre InhA - crystallized: NADH o InhA (S94A): cristales de NADH se sumergieron en una solución pyridomycin. En la penetración de pyridomicin, los cristales se volvieron amarillos, pero perdieron su capacidad de difracción. Esto sugiere que pyridomycin puede inducir grandes cambios conformacionales tras la unión a la bolsa de NADH co-factor de InhA. A efectos de control, INHA: cristales de NADH también se empaparon con triclosan, un inhibidor del sitio de unión de sustrato enoil-ACP de InhA, y la estructura resuelto con éxito, por lo tanto descartando problemas técnicos con remojo (datos no mostrados). Como una estrategia alternativa para definir el sitio de unión pyridomycin en los intentos INHA se hicieron para co-cristalizar InhA o InhA (S94A) en presencia de pyridomycin solo o con el sustrato octenoyl CoA sin embargo, a pesar de pruebas más de 1.000 condiciones, no hay cristales de difracción han sido obtenido hasta la fecha. La mutación D148G conduce a pyridomycin resistencia, así como a una disminución en la afinidad de NADH (Tabla 3). Para determinar la base molecular de esta resistencia, que cristalizado InhA (D148G) en presencia o ausencia de NADH. Al igual que con InhA y InhA (S94A), se obtuvieron cristales sólo en presencia de NADH y resuelto INHA (D148G): estructura de NADH a 2,54 (figura 5). De lo contrario, las posiciones de los otros residuos del sitio activo, así como la estructura general de la proteína eran idénticos (información de apoyo Fig 1). Figura 5. Las estructuras cristalinas de InhA (D148G) en comparación con los de tipo salvaje y InhA InhA (S94A). El mapa de densidad electrónica 2Fo-fc en 1 sigma de InhA (D148G): estructura de NADH (a 2,45) con Phe149 y NADH representa como palos. Superposición de InhA (D148G): NADH (azul) en InhA: NADH y InhA (S94A): NADH (tanto en verde) muestra claramente la mutación D148G y el 90 de rotación resultante de Phe149. Superposición de InhA (D148G): NADH (Azul) y InhA: NAD-INH (AP código 1Z1D: rosa) muestra que, en este caso, Phe149 ocupa la misma posición y explica por qué InhA (D148G) aún es sensible a la inhibición por isoniazida . Curiosamente, Phe149 en el mutante InhA (D148G) adopta la misma orientación que InhA y InhA (S94A) en el complejo con INH-NADH (Dias et al, 2007 Rozwarski et al, 1999 Vilcheze et al, 2006). Por lo tanto, en el mutante InhA (D148G), Phe149 se coloca naturalmente por Pi-apilamiento con el resto INH y esto explica la MIC sin cambios observados para la isoniazida contra de tipo salvaje InhA y la InhA (D148G) mutante in vivo (Fig 5). Además, la rotación de la cadena lateral Phe149 en el mutante InhA (D148G) también da lugar a la apertura de un canal de agua que permite la adición de dos moléculas de agua en el sitio activo, así como aumentar la distancia entre el anillo de nicotinamida de NADH y el anillo de Phe149, lo que lleva a una disminución en la afinidad de NADH según lo confirmado por estudios cinéticos (Fig 5). Los mismos cambios estructurales más probablemente también explican la disminución de la sensibilidad de InhA (D148G) para pyridomycin en comparación con el de tipo salvaje como NADH y pyridomycin comparten un bolsillo de unión similar. DISCUSIÓN Para inhibir o matar organismos competidores, numerosos microbios producen y secretan productos naturales con actividad antibiótica. Esta rica fuente de compuestos químicamente diversos se aprovechara para la producción de muchos fármacos anticancerígenos anti-microbiana y en las primeras décadas del desarrollo de antibióticos, pero luego fue abandonado (Fischbach Walsh, 2009). Dado que la presión selectiva impartida por algunos antibióticos con actividad de amplio espectro puede haber conducido a la resistencia natural en otras bacterias que comparten el mismo nicho ecológico, muchas moléculas potencialmente bio-activos pueden haber sido pasados ​​por alto (Smith et al, 2010). Las fuerzas ecológicos y evolutivos que han dado forma a los productos naturales, en particular la selección y la inhibición de los objetivos vulnerables, siguen siendo desconocidos, pero la comprensión de esta relación es importante para el descubrimiento de fármacos. El tratamiento de la tuberculosis está amenazado cada vez más por la aparición de cepas resistentes a los fármacos de M. tuberculosis y esto ha llevado a un renovado interés en la búsqueda de nuevos inhibidores bactericidas. Al igual que en otras áreas anti-infecciosos, pantallas por objetivos no han tenido éxito llevó a los investigadores a adoptar la detección de células enteras, una vez más (Cole Payne et al, 2007). En consecuencia, estamos volver a investigar diversos productos naturales para la generación de golpe ya que estos compuestos han sido optimizadas por la evolución como agentes antibacterianos. En este estudio, hemos utilizado pyridomycin, un producto natural con actividad anti-micobacteriana, para identificar la diana intracelular y caracterizado su mecanismo de acción. Pyridomycin fue descrita por primera vez en 1953 (Maeda et al, 1953), poco después de la introducción de la isoniazida en la práctica clínica, pero fue luego aparentemente descuidado. En una notable coincidencia, se muestra que, como isoniazida, pyridomycin directamente se dirige a la enoil dependiente de NADH (ACP) reductasa InhA y provoca la inhibición al competir por el bolsillo de unión de NADH. InhA (también conocido como Fab I) es un componente esencial del sistema de la sintasa de ácidos grasos de tipo II (FASII) que participan en la elongación de ácidos grasos y es necesario para la producción de micolato en M. tuberculosis. El sistema FASII está altamente conservada en bacterias, pero ausente de los seres humanos por lo que es un objetivo atractivo de drogas (Heath et al, 2002 McMurry et al, 1998 Vilcheze et al, 2006. 2011). Aunque la isoniazida es sin duda el más eficaz inhibidor conocido de InhA en M. tuberculosis. es un profármaco que requiere la activación por la catalasa KatG Roca, 2008). Nuestros resultados sugieren que pyridomycin es el producto natural más potente para inhibir FASII específicamente en M. tuberculosis y la resistencia surge debido a la remodelación del sitio de unión al NAD en InhA, en particular mediante mutación de D148G. Farmacológicamente validados objetivos de medicamentos son escasos en M. tuberculosis con InhA estar entre los mejores (Lamichhane, 2011). Por esta razón, se han hecho varios intentos para desarrollar inhibidores heterocíclicos que difieren de la isoniazida y la etionamida en su estructura y actividad. Los ejemplos incluyen compuestos de boro que contiene heterocíclicos (diazaborina) que reaccionan con NAD ribosa para formar aductos diazyborine-NAD que inhiben InhA de manera similar a INH NAD (Baldock et al, 1996). análogos Triclosan (Freundlich et al, 2009 Vilcheze et al, 2011) y los compuestos de éter de di-fenilo (Sullivan et al, 2006) han demostrado inhibir InhA con nanomalar K i y MICs micromolares y son ambos candidatos prometedores como compuestos anti-tuberculosis . más estudios de cribado para los inhibidores de Escherichia coli FabI también han revelado nuevas estructuras eficaces, muchos de los cuales sin embargo no tienen buena MIC contra M. tuberculosis (Lu Payne et al, 2002). Es de destacar que, mientras que el sistema de FASII está presente en la mayoría de las bacterias, pyridomycin es un inhibidor específico de las especies de micobacterias (Tabla 1). Entre las micobacterias prueba aquí, las proteínas INHA comparten un alto grado de identidad de secuencia (77) y ambos Asp148 y Phe149 (así como otros residuos del sitio activo) están estrictamente conservados, lo que puede explicar por qué todas las micobacterias fueron susceptibles al antibiótico. Además, otras micobacterias patógenas tales como M. leprae y M. ulcerans también comparten cerca proteínas INHA idénticos (91 y 93 de identidad con la ortholog de M. tuberculosis, respectivamente) y se espera que sean susceptibles a pyridomycin (información de apoyo Fig 1). El nivel de identidad de secuencia entre M. tuberculosis y InhA FabI de las diferentes bacterias Gram-positivas y Gram-negativas ensayadas aquí es considerablemente más baja, que van desde 27 a 33. Ni Asp148 ni Phe149 se conservan en estas enzimas, lo que probablemente explica su pyridomycin resistencia. Es posible que a través de la cohabitación con los productores de pyridomycin, o un producto natural conexo, los ancestros de estas bacterias pueden haber adquirido resistencia a los antibióticos como se ha propuesto para arylomycin, un producto natural que inhibe la peptidasa señal I (Smith et al, 2010 ). La creciente aparición de resistencia a la isoniazida en aislamientos clínicos de M. tuberculosis es un problema importante para la terapia de la tuberculosis y compromete seriamente la eficacia del tratamiento actual. En 50 Yew, 2009). Nuestros datos muestran claramente que pyridomycin no requiere activación. Esto es de particular importancia porque significa que puede matar con eficacia pyridomycin resistente a la isoniazida M. tuberculosis llevar a mutaciones katG como lo demuestra nuestra prueba de susceptibilidad de los aislados clínicos resistentes a la isoniazida. El resistente pyridomycin cepa PYR7, que lleva la mutación D148G en InhA, no es resistencia cruzada a la isoniazida y la etionamida, mientras que, por el contrario, la variante S94A que muestra resistencia a la isoniazida sigue siendo susceptible a pyridomycin (Fig 2). Esto sugiere que, mientras que los dos farmacóforos son inhibidores competitivos de NADH de unión, que se unen al bolsillo de diferentes maneras. Además, la falta de resistencia cruzada con triclosán, el andamio para otros programas de inhibidor INHA, es prometedora, ya que demuestra que hay múltiples formas de la inhibición de la misma proteína y sin resistencia cruzada que ocurre. Estos hallazgos son importantes para el diseño racional de fármacos y podrían conducir al desarrollo de pyridomycin derivados que matan múltiples micobacterias a diferencia de la isoniazida, que es eficaz únicamente frente a M. tuberculosis. MATERIALES Y MÉTODOS Información general Cepas bacterianas, condiciones de cultivo, producción y purificación pyridomycin, expresión y purificación de proteínas y detalles de materiales se describen en Materiales de apoyo de información y métodos. Determinación de la MIC pyridomycin La sensibilidad a los medicamentos de todas las bacterias se determinó usando el ensayo de resazurina de microtitulación (REMA Palomino et al, 2002). Brevemente, las bacterias en fase logarítmica se diluyeron hasta una DO 600 de 0,0001, y se cultivaron en una placa de 96 pocillos en presencia de diluciones del compuesto de serie. Después de 10 generaciones (7 días para M. tuberculosis) se determinó la viabilidad bacteriana usando 10 litros de resazurina (0,025 w / v), y se calcula como un porcentaje de la facturación resazurina en ausencia de compuesto. Metodología para la determinación de la actividad bactericida mínima (CBM) y la actividad intracelular se describen en los materiales de apoyo de información y métodos. Aislamiento y caracterización de clones de H37Rv pyridomycin resistente mutantes H37Rv Pyridomycin resistentes se aislaron en placas 10 9 CFU en sólido 7H10 medio que contiene 3C), las colonias se seleccionaron y se cultivaron en medio 7H9 sin pyridomycin. Las colonias se volvieron a ensayar a continuación para la susceptibilidad a pyridomycin, moxifloxicin, isoniazida y rifampicina. Pyridomycin clon resistente PYR7 fue seleccionado para la secuenciación de todo el genoma utilizando la tecnología de Illumina y lee alineados con la secuencia del genoma del genoma H37Rv padres para identificar SNPs (protocolos descritos en Materiales de apoyo de la Información y Métodos). El SNP en inh fue validado por secuenciación de Sanger convencional usando un analizador genético ABI3130XL (Applied Biosystems). Determinación de MIC en resistente a la isoniazida aislados clínicos de nueve aislados clínicos resistentes a la isoniazida que eran cinco (HUG). Los aislados se cultivaron hasta la fase semilogarítmica en medio líquido y se ensayaron para determinar su pyridomycin, isoniazida y moxifloxacina susceptibilidad por REMA. La sobreexpresión de la inh en H37Rv y PYR7 Para validar que genéticamente InhA fue el blanco de pyridomycin, se determinó el impacto de la sobre-expresión de tipo salvaje InhA o las formas mutantes en cepas H37Rv y PYR7. Brevemente, Quick mutagénesis dirigida al sitio de cambio se utilizó con pMVInhA donde inh se expresa a partir del promotor hsp60 en pMV261 (Larsen et al, 2002) para introducir t280g o a443g mutaciones generando así pMVInhA (S94A) y pMVInhA (D148G), respectivamente (cebadores Apoyo a la Información en la Tabla 1). Los plásmidos pMVInhA, pMVInhA (S94A) y pMVInhA (D148G) se transformaron en H37Rv y PYR7. Los transformantes fueron seleccionados utilizando kanamicina, entonces verificada mediante PCR de colonias para la presencia del casete de resistencia a la kanamicina antes de la determinación de su MIC para pyridomycin, isoniazida y moxifloxacina por REMA. Se determinó la inhibición de la síntesis de ácidos micólicos por pyridomycin La inhibición de la producción de ácidos micólicos por pyridomycin e isoniazida como se describe previamente (Vilcheze et al, 2006). II. III. IV.